Methoden & Ansätze
Unser Focus ist die quantitative Analyse zellbiologischer Mechanismen in heterogenen Zellmodellen, insbesondere mittels Mikroskopie-basierter Verfahren wie dem High Content Screening (HCS). Dies umfasst die Entwicklung neuartiger Assays und die weitgehende Automatisierung der Mikroskopie sowie Bild- und Datenanalyse. Mit diesem Ansatz können wir zahlreiche zelluläre Parameter in tausenden von Zellen zeitgleich und objektiv erfassen. Dies können z.B. die Zellzahl, die Zellgröße, die relative Position, morphologische Eigenschaften, Immunfluoreszenzintensitäten von Markerproteinen, die Anzahl von Transkripten pro Zelle oder die subzelluläre Lokalisation sein.
Im Kontext der Schmerzforschung nutzen wir HCS-Mikroskopie hauptsächlich zur Quantifizierung der Signaltransduktion in primären nozizeptiven Neuronen, assoziierten Gliazellen der Spinalganglien sowie aus iPS Zellen differenzierten Nozizeptoren. Wir haben hierzu Verfahren entwickelt, die erstmalig z.B. die Aktivität der wichtigen Signalkaskadenkomponente, PKA-II, direkt in Nervenzellen ohne vermittelnde „Reportersysteme“ ermitteln kann.
In Kooperationen wenden wir unsere Ansätze auch auf zellbiologische Mechanismen in anderen Zellmodellen. So stellen wir unsere Expertise zur objektivierten Hochdurchsatzmikroskopie z.B. Kolleginnen und Kollegen zur Verfügung, die zelluläre Stressreaktionen oder DNA-Reparaturmechanismen in Patienten-Fibroblasten und Krebszellmodellen untersuchen. Bitte kontaktieren Sie uns, wenn Sie HCS auch auf Ihr Zellmodell anwenden möchten.
Nach enzymatischem Verdau der präparierten Spinalganglien werden die isolierten Zellen in Mutiwellplatten kultiviert, stimuliert und entweder lebend oder fixiert mittels HCS-Mikroskopie (Cellomics XTI oder CX7) analysiert. Verschiedene funktionelle Assays ermöglichen die Quantifizierung der zellulären Antwort in Marker-definierten Subgruppen sensorischer Neurone (Abbildung von Jörg Isensee).
Zur Expression von Kanalrhodopsin 2 (ChR2, links unten, grün) wurden nozizeptive Neurone mit Adeno-assoziierten Viren (AAV-PHP.S) transduziert. Die optogenetisch erregbaren Zellen können dann mittels OptoPlate 96 (Bugaj et al., 2019) optogenetisch stimuliert und nachfolgend im HCS-Mikroskop analysiert werden (Abbildung von Jörg Isensee).
Gefrierschnitt des Rückenmarks der Maus. Der neuronale Marker UCHL1 und die PKA Untereinheit RIIβ wurden immunzytochemisch gefärbt, die Kerne mit DAPI. RIIβ wurde in den äußeren Laminae des Dorsalhorns detektiert, in welchen sich die zentralen Termini nozizeptiver Neurone befinden (Abbildung von Jörg Isensee).
Konfokale Aufnahmen von Gefrierschnitten lumbaler Spinalganglien nach Immunfluoreszenzfärbung (10 µM dick, Skalierung = 50 µM). Der neuronale Marker UCHL1 (grau) wurde zur Erstellung einer Bildmaske genutzt (links unten), welche die Quantifizierung der Expression der Subgruppen-spezifischen Marker RIIβ (rot) und IB4 (grün) ermöglicht (Abbildung von Jörg Isensee).
Penk-mRNA wurde mittels fluoreszenter in situ Hybridisierung (FISH) detektiert, der neuronale Marker UCHL1 (grün) mittels Immunfluoreszenz und die Zellkerne mit Hoechst 34580.
Zur Bildung von Stressgranules (oben rechts, rot) wurden HeLa-Zellen für 1 h mit 0.5 mM Natriumarsenit behandelt (Abbildung von Christian Kähler / Jörg Isensee).
Die Zellkörper der aus iPS-abgeleiteten Nozizeptoren wurden mit fluoreszierendem Nissel gefärbt (grün), die Neuriten mittels Immunfluoreszenz gegen die PKA Untereinheit RIIβ, die Kerne mit Hoechst 34580 (Abbildung von Andreea Belu).
Primäre dermale Fibroblasten wurden für 1 h mit Hydroxyurea (20 mM) behandelt und nach 48 h fixiert (Abbildung von Ron Jachimowicz / Jörg Isensee).
Phasenkontrastaufnahmen von Gefrierschnitten des Ischiasnerv wurden zur Erstellung einer Maske genutzt, welche die Quantifizierung der Anzahl und Größe der Nervenfasern erlaubt (Abbildung von Ilja Bobylev / Jörg Isensee).